TEMA: Desarrollo y evaluación de un nuevo ensayo rápido de PCR y secuenciación de ADN ribosómico 16S de amplio espectro para el diagnóstico de la endocarditis infecciosa.
OBJETIVO: Explorar la sensibilidad y la especificidad de un nuevo ensayo rápido de PCR y secuenciación de rDNA 16S para el diagnóstico mejorado de endocarditis infecciosa (EI) en pacientes con sospecha de infección valvular cardíaca (HV) nativa o protésica durante un período de varios años en nuestro centro cardiovascular.
MUESTRA: Hemocultivo y tejido de válvula cardiaca.
ÁCIDO NUCLÉICO: ADNr
EXTRACCIÓN:
- SEPARACIÓN: El ADN se extrajo utilizando el protocolo QIAamp DNA Mini Kit para tejidos (QIAGEN, Hilden, Alemania).
- LISIS: Las muestras se sometieron a vórtex brevemente y se incubaron a 56 ° C, en un termomezclador Eppendorf a 1400 rpm durante un mínimo de 2 h.
- PURIFICACIÓN: El ADN en la digestión proteolítica se purificó adicionalmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se eluyó en 150 μL de tampón AE. Eluato de ADN se almacenó a -20 ° C hasta su uso.
GEN A AMPLIFICAR:
Gen rDNA de 16S
16SDPO_F: AGAgTTTgATCMTGGCTCA-IIIII-AACGCT (M = A / C; I = desoxinosina; 16SDPO_R: CGCGGCTGCTGGCA-IIIAI-TTRGC (R = A / G; I = desoxinosina
PCR: estándar
- Desnaturalización inicial a 95 ° C
- Hibridación: 40 ciclos de 94 ° C durante 1 minuto, 62 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 1 minuto.
- Extensión final a 72 ° C durante 5 min.
VISUALIZACIÓN: Electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% que contenía SYBRsafe (Life Technologies)
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Referencias bibligraficas
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